MPXV PCR Monkeypox Virus Multiplex essiccato per congelamento in tempo reale PCR Detection

PROCEDURA OPERATIVA

1) Estrazione dell'acido nucleico Estrarre il DNA dai campioni utilizzando un kit di estrazione appropriato. Si raccomanda di eluire l'acido nucleico con circa 100 μl di tampone di eluizione (TE o H2O priva di nucleasi) nella fase finale dell'estrazione. L'acido nucleico purificato deve essere utilizzato immediatamente o conservato a -20°C.

2) Preparazione del controllo positivo Il controllo positivo può essere conservato a temperatura ambiente prima della reidratazione per un massimo di 12 mesi. Deve essere reidratato prima dell'uso aggiungendo 250 μl di tampone TE o H2O priva di nucleasi, vorticato a bassa velocità per 15-20 secondi e centrifugato a bassa velocità per 15-20 secondi. Utilizzare immediatamente o conservare a -20°C.

3) Preparazione del mix RT-PCR in tempo reale

A) Aprire la confezione sottovuoto ed estrarre le strisce a 8 provette contenenti il reagente. Verificare che il pellet sia sul fondo della provetta (tagliare il numero di provette necessarie, se necessario). Se le provette fornite non sono compatibili con lo strumento, trasferire il pellet del reagente in una provetta ottica compatibile con lo strumento.

B) Aprire le provette e scartare il/i tappo/i (non adatto/i per le macchine PCR in tempo reale) e preparare il mix di reazione su ghiaccio come di seguito

* L'acqua priva di nucleasi può essere utilizzata come controllo negativo.

C) Sigillare le provette con tappi ottici o piastra a 96 pozzetti con pellicola di sigillo ottica (non fornita).

D) Vorticare le provette a bassa velocità per 10~15 secondi e centrifugare a 3000 giri/min per 20 secondi e posizionarle in uno strumento PCR in tempo reale.

3) Impostazione RT-PCR: Impostare il volume di reazione a 25μl e la procedura di amplificazione PCR come di seguito. Raccogliere la fluorescenza FAM (per il gene N), HEX (per il gene E), ROX (per Orf1ab) e CY5 (per il gene RNase P) a 60°C e selezionare NESSUNO come riferimento passivo.
4) Analisi e interpretazione dei risultati Impostare la linea di soglia in base alle istruzioni dello strumento.

A) Controllo di qualità:

B) Interpretazione dei risultati del campione

Parametri tecnici: